突破前列腺癌治療困境！靶向納米藥雙管齊下：逆轉(zhuǎn)耐藥 + 激活免疫

《Advanced Materials》是材料科學(xué)領(lǐng)域的國(guó)際頂級(jí)期刊，由 Wiley 出版，創(chuàng)刊于 1989 年，以跨學(xué)科性為核心特色，涵蓋材料化學(xué)、物理、納米技術(shù)、生物醫(yī)學(xué)材料等前沿方向（如納米顆粒遞送、腫瘤治療等）。

影響因子：26.8

期刊ISSN：0935-9648

出版周期：Semimonthly

自引率：5.50%

發(fā)文量：3616（2024年）

一、 研究背景

在全球癌癥領(lǐng)域，前列腺癌因高發(fā)病率與死亡率構(gòu)成嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，盡管早期治療有所進(jìn)步，但晚期患者治療選擇受限，其中化療與免疫治療耐藥是核心障礙，前者與 ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（如 P-gp）介導(dǎo)的藥物外排相關(guān)，后者源于免疫抑制性腫瘤微環(huán)境（TME）中髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）的免疫逃逸作用，PI3K/AKT/mTOR（PAM）信號(hào)通路的過(guò)度激活是關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)，既通過(guò)上調(diào) P-gp 增強(qiáng)化療耐藥，又依賴通路激活維持 MDSCs 的免疫抑制功能。雖然 PI3K/mTOR 雙抑制劑 BEZ235 展現(xiàn)出了逆轉(zhuǎn)多種癌癥治療耐藥的潛力，但其對(duì)前列腺癌中 P-gp 表達(dá)調(diào)控及 MDSCs 抑制的研究不足，并且存在自身水溶性差、生物利用度低的問(wèn)題，嚴(yán)重制約了臨床轉(zhuǎn)化。

為突破上述局限，研究人員構(gòu)建了靶向前列腺特異性膜抗原（PSMA，前列腺癌特異性表達(dá)的跨膜糖蛋白）的納米藥物遞送系統(tǒng)：將 PSMA 配體與谷胱gan肽（GSH）敏感聚合物（GSP）偶聯(lián)形成 PSMA-GSP，其可自組裝并負(fù)載 BEZ235 前藥，構(gòu)建成納米顆粒（PSMA-NP/BEZ）。該系統(tǒng)不僅提升了 BEZ235 的水溶性與生物利用度，還能借 PSMA 靶向?qū)崿F(xiàn)前列腺癌組織精準(zhǔn)富集，在腫瘤高 GSH 環(huán)境下釋放 BEZ235，通過(guò)抑制 PAM 通路，既能夠抑制癌細(xì)胞增殖、下調(diào) P-gp 以增強(qiáng)化療敏感性，又能夠抑制 MDSCs 活性以重塑免疫微環(huán)境；與 PD-1 單抗（αPD-1）聯(lián)用時(shí)可協(xié)同增強(qiáng)免疫療效，最終形成 “化療 + 免疫 + 靶向" 的新型治療范式，為晚期前列腺癌患者改善治療結(jié)局、降低毒性提供了新思路。

二、 研究結(jié)果

1. 前列腺癌中的PAM信號(hào)傳導(dǎo)通路

為探究 PI3K/mTOR 雙靶點(diǎn)抑制劑 BEZ235 在前列腺癌中的治療潛力，研究人員通過(guò) TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中（PI3K/AKT/mTOR） PAM 通路相關(guān)基因表達(dá)顯著高于正常組織，再經(jīng)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)該類(lèi)基因在 MDSCs、巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)（MDSCs 中 PAM 通路激活最高），且其表達(dá)與 MDSCs 比例呈顯著正相關(guān)，最終表明 PAM 通路或?qū)η傲邢侔┻M(jìn)展重要且與癌癥免疫抑制微環(huán)境中的 MDSCs 密切相關(guān)。

2. PSMA-NP/BEZ的制備與表征

鑒于前列腺癌 PSMA 高表達(dá)及高 GSH 特征，研究人員先合成GSP 并偶聯(lián) PSMA 配體得到了 PSMA-GSP，再用納米沉淀法制備載 BEZ235 的 PSMA-NP/BEZ 與 NP/BEZ；PSMA-NP/BEZ 為球形（95nm）、膠體穩(wěn)定，可靶向前列腺癌細(xì)胞，且因二硫鍵具 GSH 響應(yīng)性，10μm GSH 下 24h 釋藥 60%，nonNP/BEZ 無(wú)變化。

3. PSMA-NP/BEZ的細(xì)胞內(nèi)攝取

為提升納米顆粒腫瘤靶向能力，研究人員對(duì)其表面修飾 PSMA 配體；將 Cy5.5 標(biāo)記的 NP/BEZ@Cy5.5 與 PSMA-NP/BEZ@Cy5.5 和 C4-2 細(xì)胞共孵育，F(xiàn)CM 檢測(cè)顯示 1 小時(shí)后 PSMA-NP/BEZ 組細(xì)胞 MFI 是 NP/BEZ 組的 9.7 倍，PSMA 配體預(yù)處理會(huì)降低熒光強(qiáng)度，證實(shí) PSMA 介導(dǎo)特異性攝取；后續(xù)用 FCM 和 CLSM 分析，發(fā)現(xiàn) PSMA-NP/BEZ 處理后 1-12 小時(shí)胞內(nèi)熒光維持高水平，表明其延長(zhǎng) BEZ235 細(xì)胞內(nèi)滯留時(shí)間，符合納米顆粒增強(qiáng)藥物蓄積、減少外排的假設(shè)。

4. PSMA-NP/BEZ的體外細(xì)胞毒性

為評(píng)估 PSMA-NP/BEZ 的抗癌活性，研究人員通過(guò)MTT 法發(fā)現(xiàn)，在 RM-1、C4-2、PC-3 前列腺癌細(xì)胞系中，PSMA-NP/BEZ 的細(xì)胞毒性強(qiáng)于 BEZ235 和 NP/BEZ，對(duì) PSMA 陽(yáng)性的 RM-1 細(xì)胞 IC50 僅 40 nM，為后兩者的 1/150 和 1/117.5；流式細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，其誘導(dǎo) C4-2 細(xì)胞凋亡率顯著高于另外兩組，死亡細(xì)胞比例也更高；克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，該組 C4-2 細(xì)胞克隆數(shù)遠(yuǎn)少于另兩組。此外，WB結(jié)果顯示PSMA-NP/BEZ不會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫原性細(xì)胞死亡，與預(yù)期一致。

5. PSMA-NP/BEZ對(duì)PAM信號(hào)通路的體外抑制作用

為了探究 PSMA-NP/BEZ 的作用機(jī)制，研究人員對(duì)經(jīng) PBS、BEZ235 和 PSMA-NP/BEZ 處理的 C4-2 細(xì)胞進(jìn)行 RNA 測(cè)序和 WB 分析，結(jié)果顯示 PSMA-NP/BEZ 與 BEZ235 僅存在 12 個(gè)差異表達(dá)基因，PCA 分析也證實(shí)兩者作用機(jī)制高度相似，其中 MMP9 雖在兩組間有顯著差異表達(dá)且表達(dá)模式獨(dú)特，被推測(cè)可能是機(jī)制差異關(guān)鍵基因，但 WB未檢測(cè)到兩者 MMP9 蛋白水平的顯著差異；進(jìn)一步通過(guò)富集分析與 WB實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PSMA-NP/BEZ 可顯著抑制 PAM 及 mTOC1 信號(hào)通路，降低 PAM 通路關(guān)鍵蛋白PI3K、p-AKT、p-mTOR及下游 p-S6 的表達(dá)，還能顯著下調(diào)細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制修復(fù)、p53 信號(hào)通路等 PAM 下游通路相關(guān)基因，綜上可知 PSMA-NP/BEZ 與 BEZ235 作用機(jī)制相似，均通過(guò)抑制 PAM 通路、破壞細(xì)胞增殖等功能發(fā)揮抗癌作用。

6. PSMA-NP/BEZ的生物分布

為提升納米顆粒腫瘤靶向性，研究人員在其表面修飾 PSMA 配體，在RM-1 前列腺癌皮下腫瘤模型中，通過(guò)注射熒光標(biāo)記的 NP/BEZ@Cy5.5（未修飾 PSMA）與 PSMA-NP/BEZ@Cy5.5結(jié)果顯示，NP/BEZ@Cy5.5在腫瘤部位 12 小時(shí)達(dá)蓄積峰值后，48 小時(shí)仍維持高滯留，離體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其腫瘤熒光強(qiáng)度顯著高于肝腎，且免疫熒光顯示其能穿透血管、在腫瘤組織廣泛分布；PSMA-NP/BEZ@Cy5.5 8-12 小時(shí)達(dá)峰后下降，主要在肝腎富集。綜上，PSMA-NP/BEZ能通過(guò)血管有效滲透至腫瘤內(nèi)部。

7. PSMA-NP/BEZ的體內(nèi)抗腫瘤療效

研究人員在C57BL/6J小鼠體內(nèi)構(gòu)建了RM-1前列腺癌模型，PBS、BEZ235、NP/BEZ、PSMA-NP/BEZ每?jī)商焯幚?1 次，共 3 次。結(jié)果顯示，所有組均無(wú)體重減輕及血清異常，PSMA-NP/BEZ 組生物安全性良好；且其腫瘤抑制率達(dá)到57.9%，平均腫瘤重量（0.67±0.20g）遠(yuǎn)低于其他組，而 BEZ235、NP/BEZ 組未控制住腫瘤進(jìn)展。

8. PSMA-NP/BEZ 刺激抗腫瘤免疫

為了驗(yàn)證PSMA-NP/BEZ抗腫瘤功效，研究人員發(fā)現(xiàn)PSMA-NP/BEZ可使小鼠腫瘤組織中MDSCs比例從42.0%降至22.3%，同時(shí)提升腫瘤組織中細(xì)胞毒性T細(xì)胞比例、淋巴結(jié)成熟DCs比例，并減少腫瘤Treg細(xì)胞，表明其可重塑前列腺癌“冷"免疫微環(huán)境、激活抗腫瘤免疫。

9. PSMA-NP/BEZ聯(lián)合PTX的治療療效

以 P-gp為代表的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白會(huì)將藥物排出細(xì)胞導(dǎo)致耐藥，在zi杉醇（PTX）耐藥的前列腺癌細(xì)胞中 P-gp 過(guò)表達(dá)，而抑制 PI3K 通路可通過(guò)降低P-gp 逆轉(zhuǎn)耐藥，研究人員推測(cè) PSMA-NP/BEZ 能增強(qiáng) PTX 抗癌效果。研究人員發(fā)現(xiàn)，體外四種前列腺癌細(xì)胞系中，PTX+PSMA-NP/BEZ 聯(lián)用抗癌活性強(qiáng)于單獨(dú)用藥，PSMA 陽(yáng)性細(xì)胞中更顯著，且聯(lián)用可降低 PTX 誘導(dǎo)升高的 P-gp 水平；體內(nèi) RM-1 荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)中，PTX 單獨(dú)抑瘤弱，而聯(lián)用組腫瘤抑制率顯著高于 PTX和 PSMA-NP/BEZ組，平均腫瘤重量也更低，免疫組化結(jié)果顯示聯(lián)用組 Ki67和 P-gp 表達(dá)均降低。綜上，這些結(jié)果表明，PTX +PSMA-NP/BEZ 的聯(lián)合治療對(duì)前列腺癌具有優(yōu)異的抗腫瘤功效，其作用機(jī)制通過(guò)下調(diào) P-gp 的表達(dá)來(lái)降低 PTX 的耐藥性。

10. PSMA-NP/BEZ與αPD-1之間的協(xié)同效應(yīng)

為探究PSMA-NP/BEZ與αPD-1聯(lián)用的潛力，研究人員構(gòu)建了前列腺癌復(fù)發(fā)模型：在小鼠右髖接種原發(fā)腫瘤后，分別用PBS、αPD-1、PSMA-NP/BEZ及二者聯(lián)用處理，6天后切除原發(fā)腫瘤模擬臨床gen治性切除，記錄小鼠存活、體重及腫瘤體積。結(jié)果顯示，PSMA-NP/BEZ未加重αPD-1導(dǎo)致的體重減輕，安全性良好；在原發(fā)腫瘤方面，αPD-1單獨(dú)處理與PBS組無(wú)差異，PSMA-NP/BEZ單獨(dú)處理抑瘤率為54%，而聯(lián)用組抑瘤率達(dá)到82.5%，抑瘤效果更加；原發(fā)腫瘤切除后，除2只小鼠因手術(shù)相關(guān)原因死亡外，聯(lián)用組較其他組而言能夠延緩腫瘤復(fù)發(fā)、延長(zhǎng)小鼠存活時(shí)間。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用組小鼠脾臟中CD44?CD62L?中樞記憶T細(xì)胞占比（8.6%）高于單獨(dú)處理組，血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IFN-γ濃度也更高。綜上，αPD-1與PSMA-NP/BEZ聯(lián)用可激活抗腫瘤免疫、誘導(dǎo)免疫記憶，進(jìn)而預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。

三、 研究結(jié)論

該篇研究構(gòu)建了 PSMA 靶向、GSH 敏感的納米遞送系統(tǒng) PSMA-NP/BEZ（負(fù)載 BEZ235），既能解決BEZ235 水溶性差、生物利用度低的問(wèn)題，又能精準(zhǔn)靶向前列腺癌并在高 GSH 微環(huán)境響應(yīng)釋藥。其通過(guò)抑制 PAM 通路，破壞癌細(xì)胞功能、下調(diào) P-gp 以增強(qiáng)zi杉醇化療敏感性，還能滅活 MDSCs 重塑免疫微環(huán)境，聯(lián)合 αPD-1 可增效免疫治療并誘導(dǎo)免疫記憶；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其安全，抑瘤效果優(yōu)于游離 BEZ235 及非靶向系統(tǒng)，為晚期前列腺癌提供 “化療增敏 - 免疫重塑" 策略。