ELISA檢測的ELISA基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。
1、加樣：將標準品工作液依次加入到前兩列孔中，每個濃度的工作液并列加兩孔，每孔100 μL。待測樣品加入到其他孔，每孔100 μL(若樣本濃度高于檢測范圍，需用標準品&樣本稀釋液稀釋后取樣)。給酶標板覆膜，37℃孵育90分鐘。提示：加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，避免產生氣泡。加樣時間宜控制在10分鐘內。
2、生物素化抗體/抗原：棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中立即加入生物素化抗體/抗原工作液100 μL，混勻，酶標板加上覆膜， 37℃孵育1小時。
3、洗滌：甩盡孔內液體，每孔加洗滌液350 μL，浸泡1-2分鐘，吸去或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干。重復此洗板步驟3次。提示：此處與其他洗板步驟都可用洗板機。每一步洗滌充分是實驗的根本。
4、HRP酶結合物：每孔加酶結合物工作液100 μL，混勻，加上覆膜，37℃孵育30分鐘。
5、洗滌：棄去孔內液體，洗板5次，方法同步驟3。
6、底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混勻，加上覆膜，37℃避光孵育15分鐘左右。提示：根據實際顯色況酌情縮短或延長孵育時間，但不可超過30分鐘。當標準孔出現明顯梯度時，即可終止。
7、終止：每孔加終止液50 μL，終止反應。提示：終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。
8、讀值：立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔的光密度(OD值)。應提前打開酶標儀預熱，設置好檢測程序。
9、實驗完畢后，將未用完的試劑按規定的保存溫度放回冰箱保存至保質期。
